近日，国际综合性Top期刊GigaScience（JCR 1区，IF=11.8）以Research Article形式在线刊发了海洋所李军研究团队与刘静研究团队合作完成的最新研究成果，该成果创新性建立了一种鱼类低成本、高通量、易检测的大片段结构变异（SVs＞100bp）性别特异性标记开发技术，解决了鱼类性别鉴定标记少、鉴定效率低、现场应用难的问题，为助力鱼类性别决定机制深入研究和性控育种提供了重要技术手段，同时也为其他养殖生物类群性别特异性标记精准开发提供了借鉴。

鱼类性别特异性标记技术开发历程

鱼类性别特异性标记的开发始于20世纪90年代，分为三个主要时期：性别标记探索期（1991~2006）、性别标记筛选突破期（2007~2012）和性别标记筛选快速发展期（2013~2023）。前两个时期性别鉴定采用的方法主要是DNA指纹图谱识别技术，如RFLP、RAPD、AFLP、SSR等，这些技术存在性别鉴定标记少、实验操作过程复杂、鉴定效率不稳定等问题。自2012年来以Illumina为代表的二代高通量测序技术快速发展（如PE150），使得鱼类性别标记筛选进入到了SNP/InDel级别，精准度明显提高，但投入成本高昂、现场性别鉴定操作难以实现等问题，制约了鱼类性别控制育种产业发展进程。目前，随着以PacBio为代表三代高通量测序技术的快速发展，特别是Revio系统的推出，其长读长（10kb~20kb）测序技术使得基于大片段结构变异（SVs＞100bp）的性别特异性标记高通量精准开发成为可能，这标志着鱼类性别特异性标记开发进入了一个新时代，将大大推动鱼类性别控制育种产业的快速发展。

条石鲷性别特异性标记高效开发示意图

条石鲷隶属于石鲷科石鲷属，为我国网箱、工厂化养殖以及海洋牧场增殖重要新对象。团队通过前期研究发现条石鲷类性状典型：具“鸟喙状”愈合齿；雌雄生长二态性；雄鱼（2n=47）染色体较雌鱼（2n=48）少一条，且雄鱼染色体中存在一条体型异常巨大的染色体（X1X1X2X2/X1X2Y）。肖永双副研究员于2019年和2020年在国际上率先系统揭示条石鲷雄鱼异型染色体融合起源机理（成果发表在iScience，GigaScience）基础上，针对具生长二态性X1X2Y系统鱼类雄性单性育种的需求，基于已发表的条石鲷雌、雄线性基因组信息采用全基因组变异位点高效扫描和双向比对的策略，生成雌雄基因组间大片段结构变异（>100 bp）DNA插入/缺失变异数据库，测算插入/缺失位点CLR数据深度并对标记位点排序，运用目标标记区域引物高通量设计技术和电子PCR（e-PCR）技术对候选标记进行高通量数字模拟扩增和筛选，通过琼脂糖凝胶电泳进行现场验证，构建了条石鲷雌、雄遗传性别鉴定的高通量精准标记数据库。研究团队基于上述技术开发流程，分别获得3645（2852 INS/874 DEL SVs）和3872个（3077 INS/833 DEL SVs）雌雄性别特异性标记，以及1021个（12.50，以♂为参考）和894个（5.48，以♀为参考）高置信的遗传性别鉴定标记。研究进一步发现，高比例的缺失序列标签变异位点主要定位在转座因子区域（78.44%）和串联重复序列区域（33.67%），研究为鱼类染色体大型结构变异的插入-缺失事件发生模式提供新的见解。

条石鲷雌雄大片段结构变异位点挖掘、识别、分类及高置信标记锚定

条石鲷性别特异性标记位点e-PCR检验以及琼脂糖凝胶验证

研究团队基于长读长测序技术（~10kb）开发的条石鲷性别特异性标记的新技术流程，与第一代和第二代性别鉴定技术相比，该方法能够获得更多的大型结构变异（＞100bp）性别特异性标记，显著提高了扩增和现场检测识别效率，同时降低了性别鉴定检测成本，成果成功应用于条石鲷、斑石鲷雌、雄以及缟虾虎鱼属种质鉴定，获得授权国家发明专利13项。同时，该技术可以与PacBio和ONT等长读长数据无缝衔接。此外，该方法可适用于多种性别决定系统，尤其适合具有异形染色体的系统（如XY、ZW、XX/XY1Y2、ZZ/ZW1W2）及其他性别决定机制的物种。这一创新成果将为海水鱼类性控育种提供强大技术支持，推动海水鱼类育种相关产业的快速发展。

中国科学院海洋研究所为文章第一完成单位，肖永双副研究员和肖志忠研究员为论文第一作者，李军研究员和刘静研究员为文章共同通讯作者。该研究得到了国家自然基金面上项目、国家重点研发计划、中国科学院海洋大科学研究中心重点部署项目（前沿交叉类）等项目联合资助。

文章目录：

1、Yongshuang Xiao#, Zhizhong Xiao#, Lin Liu#, Yuting Ma, Haixia Zhao, Yanduo Wu, Jinwei Huang, Pingrui Xu, Jing Liu*, Jun Li*. Innovative approach for high-throughput exploiting sex-specific markers in Japanese parrotfish Oplegnathus fasciatus. GigaScience. 2024, giae045, 13: 1-16. https://doi.org/10.1093/gigascience/giae045

2、Yongshuang Xiao#, Zhizhong Xiao#, Daoyuan Ma, Jing Liu*, Jun Li*. Genome sequence of the barred knifejaw Oplegnathus fasciatus (Temminck & Schlegel, 1844): the first chromosome-level draft genome in the family Oplegnathidae. GigaScience, 2019, giz013, 1-8. https://doi.org/10.1093/gigascience/giz013

3、Yongshuang Xiao#, Zhizhong Xiao#, Daoyuan Ma, Chenxi Zhao, Lin Liu, Hao Wu, Wenchao Nie, Shijun Xiao*, Jing Liu* and Jun Li*, Angel Herrera-Ulloa. Chromosome-level Genome Reveals the Origin of Neo-Y Chromosome in the Male Barred knifejaw Oplegnathus fasciatus. iScience,2020. 23, 101039. (Cell子刊)

授权国家发明专利目录：

1. 肖永双，赵海霞，李军，肖志忠等。授权日期2024/5/28，专利号ZL 2024 1 0257085.5。

2. 肖永双,李军,肖志忠等。授权日期2024/3/11，专利号ZL 2024 1 0269995.5。

3. 肖永双，马玉婷，肖志忠，李军等。授权日期2024/3/12，专利号ZL 2024 1 0275540.4。

4. 肖永双，吴燕铎，李军，肖志忠等。授权日期2024/5/31，专利号：ZL 2024 1 0275541.9。

5. 肖永双，肖志忠，李军等。授权日期2024/6/18，专利号：ZL 2024 1 0330538.2。

6. 肖永双，李军，肖志忠等。授权日期2024/6/4，专利号：ZL 2024 1 0338304.2。

7. 肖永双，肖志忠，李军等。授权日期2024/6/14，专利号：ZL 2024 1 0346897.7。

8. 肖永双，肖志忠，李军等。授权日期2024/6/11，专利号：ZL 2024 1 0354461.2。

9. 肖永双，肖志忠，李军等。授权日期2024/6/7，专利号：ZL 2024 1 0354464.6。

10. 肖永双，肖志忠，李军等。授权日期2024/6/18，专利号：ZL 2024 1 0355231.8。

11. 肖永双，陈少华，韦杰鸿，肖志忠，李军等。授权日期2024/3/1，专利号：ZL 2023 1 1733365.0。

12. 肖永双，吴燕铎，李军，肖志忠等。授权日期2022/5/6，专利号：ZL 2022 1 0083551.3。

13. 肖永双，马玉婷，李军，肖志忠等。授权日期2022/5/6，专利号：ZL 2022 1 0088031.1。

文章链接：

https://doi.org/10.1093/gigascience/giae045