中科院海洋所张鑫课题组和孙超岷课题组共同合作，基于共聚焦显微拉曼技术，通过三维定量成像实现了长期、近实时、非破坏性的微生物监测，对微生物生长和代谢情况进行可视化及定量分析，为未来分析微生物原位生物过程提供了新思路。研究成果近日发表于国际学术期刊《微生物学谱》（Microbiology Spectrum，IF= 9.043）上。 

　　张鑫课题组在之前的工作中，观测到我国南海冷泉环境中单质硫含量丰富。随后孙超岷课题组发现了冷泉细菌Erythrobacter flavus 21-3可以高效氧化硫代硫酸钠生成单质硫，张鑫课题组通过拉曼光谱鉴定后发现单质硫结构为环状S₈，研究成果发表在生物学领域权威期刊《国际微生物生态学会杂志》（The ISME Journal）。后续两个课题组合作将E. flavus 21-3及其突变株布放到深海冷泉喷口附近进行原位培养，证实该菌株在深海原位环境中也能形成硫单质，相关成果发表在国际生物学期刊《微生物学》（mBio），为解释我国南海冷泉喷口广泛分布硫单质的成因提供了重要理论依据。 

　　由此可见，微生物是深海硫形成和循环的重要贡献者，其介导的硫代谢的研究对于了解深海硫循环至关重要。然而，由于深海环境极端复杂，采样困难、微生物难于分离培养等因素，以及缺少对硫元素的形成的近实时无损的监测方法，深海微生物的原位探测面临巨大挑战。目前主要通过经典的生物和化学方法研究硫元素的生成过程，例如X射线吸收近边结构、高效液相色谱、透射电子显微镜、离子色谱法或化学计量法等。但是这些方法主要通过取样来获知特定时间点的微生物代谢情况，不能在不破坏样品的前提下连续监测其在时间尺度上的代谢过程；并且其中一些方法样品制备复杂，会破坏细胞的原位真实性；也可能会出现取样不均匀及污染的情况，导致难以实现连续的原位观察。因此，亟需新的方法突破此瓶颈。 

　　共聚焦显微拉曼三维成像技术拥有低成本、快速、无标签和无破坏性的优势，具有将定性、定量和可视化完美结合的潜力，为我们解决相关问题提供了新的思路。因此，为证明此技术的潜力，研究团队构建了一套固态基底上微生物群落拉曼三维定量原位分析方法，将光学可视化与拉曼定量分析相结合，可在时间和空间两个维度上无损定量表征微生物群落代谢过程。该技术已成功应用到深海冷泉细菌E. flavus 21-3硫代谢过程的原位监测。基于拉曼三维成像进行体积计算和比率分析，对不同环境下的菌落生长和代谢进行了量化，发现了生长和代谢方面不为人知的细节，为厘清深海冷泉生物群落中广泛分布的硫单质成因提供了重要技术支持。据我们所知，这是首次尝试长期监测菌落在固体培养基中生长的原位无损技术。我们能够快速确定代谢产物，推断反应发生的途径，并快速筛选产硫细菌。由于这一成果的应用，不仅证明了该方法在未来对微生物原位过程的可视化及定量分析的潜力，也为研究深海中附着在岩石沉积物等固体表面上的微生物提供了新的思路。 

图1 固体培养基培养的菌落的三维定量成像示意图

图2 E. flavus 21-3在高氧条件下的三维拉曼成像分析

(A) E. flavus 21-3的三维拉曼成像，其中黄色代表S₈，绿色代表类胡萝卜素。(B) E. flavus 21-3的拉曼光谱：黑色代表生成的S₈，绿色代表生成的类胡萝卜素。(C) 在高氧条件下生长的E. flavus 21-3的类胡萝卜素的累积量和变化率。(D) 在高氧条件下生长的E. flavus 21-3的S₈的累积量和变化率

图3 低氧条件下E. flavus 21-3的三维拉曼成像分析

(A) E. flavus 21-3的三维拉曼成像，其中黄色代表S₈，绿色代表类胡萝卜素。(B) 低氧条件下E. flavus 21-3中类胡萝卜素的累积量和变化率。(C) 低氧条件下E. flavus 21-3中S₈的累积量和变化率

图4 不同含氧量条件下E. flavus 21-3中与硫转化有关的代谢产物的拉曼特征峰面积比值分析

(A)高氧条件，(B)低氧条件

　　中科院海洋所博士研究生何婉莹、蔡瑞宁为文章共同第一作者，研究员张鑫、孙超岷为文章通讯作者，正高级工程师栾振东、副研究员杜增丰、博士席世川、硕士研究生殷子钰为文章共同作者。研究得到了国家自然科学基金、中国科学院A类战略性先导专项、中国科学院海洋大科学研究中心重点部署项目、泰山青年学者计划等项目联合资助，以及WITec公司吴望华博士和胡海龙博士的支持。 　　 

　　相关成果如下： 　　 

　　Wanying He; Ruining Cai; Shichuan Xi; Ziyu Yin; Zengfeng Du; Zhendong Luan; Chaomin Sun*, Xin Zhang*. Study of microbial sulfur metabolism in a near real-time pathway through confocal Raman quantitative 3D imaging[J]. Microbiology Spectrum, 2023, IF= 9.043. 

　　论文DOI: 10.1128/spectrum.03678-22 

　　Jing Zhang; Rui Liu; Shichuan Xi; Ruining Cai; Xin Zhang, Chaomin Sun*. A novel bacterial thiosulfate oxidation pathway provides a new clue about the formation of zero-valent sulfur in deep sea[J]. The ISME Journal, 2020,14(9):2261-2274. 

　　论文DOI: 10.1038/s41396-020-0684-5 

　　Ruining Cai; Wanying He; Rui Liu; Jing Zhang; Xin Zhang, Chaomin Sun*. Deep-sea in situ insights into the formation of zero-valent sulfur driven by a bacterial thiosulfate oxidation pathway[J]. mBio, 2022,13(4):e14322. 

　　论文DOI: 10.1128/mbio.00143-22